• Apparition en 1970: B Hesper et P Hogeweg, « Bioinformatica: een werkconcept », Kameleon, vol. 1, no 6, 1970, p. 28–29

La bio-informatique est constituée par l’ensemble des concepts et des techniques nécessaires à l’interprétation informatique de l’information biologique. Plusieurs champs d’application ou sous-disciplines de la bio-informatique se sont constitués (Wikipedia):

• La bio-informatique des séquences
• La bio-informatique structurale
• La bio informatique des réseaux
• La bio-informatique statistique et des populations

• Idée lancée en 1985 par 3 scientifiques, Renatto Dulbecco, Robert Sinsheimer (directeur de UCSC) et Charles DeLisi, qui financera le projet (Directeur dept. de biologie du Département de l’Energie US)
• Séquençage lancé en 1988 par le National Research Council. En suisse est créé HUGO (Human Genome Organisation) pour la coordination.
• En 1998, Craig Venter, crée Celera Genomics avec pour objectif le séquençage en 3 ans par séquençage Shotgun et le brevetage du génome (!).
• En 2000, la complétion du séquençage est annoncé pour le Consortium et Celera Genomics (match nul) par le président B. Clinton. Coût: $3B.
• Celera Genomics avouera avoir utilisé les données du Consortium pour son propre assemblage, mais reproduira un séquençage de Novo 3 ans plus tard…
• Publication des séquences brutes en 2001 et des séquences finales en 2004.

https://planet-vie.ens.fr/thematiques/manipulations-en-laboratoire/la-revolution-de-la-genomique-les-nouvelles-methodes-de

• Séquençage Sanger: faible débit, utilisée pour le séquençage du génome humain

• Séquençage de nouvelle génération: adapté au séquençage massif d’un grand nombre de génome pour étudier les variations génétiques (GWAS). Le leader du marché aujourd’hui est Illumina.

Le principe d’un séquençage NGS consiste à:

• Créer une librairie de fragments d’ADN (par fragmentation enzymatique et mécanique de l’ADN génomique).
• Relier ces fragments à des adaptateurs, des petites molécules d’ADN de séquences connues nécéssaires au séquençeur.
• Une sélection de la taille minimum et maximum des fragments est effectuée pour des raisons techniques, notamment l’amplification PCR.
• Faire une amplification PCR des fragments.
• Faire le séquençage.

• Hybridation d’un brin sur un oligonucléotide attaché à la FlowCell

• Un brin complémentaire est synthétisé.

• La molécule d’origine est enlevée et la molécule libre s’hybride en pont.

• Un brin supplémentaire est synthétisé de nouveau.

• Les brins complémentaires à la cellule d’origine sont lavés et il ne reste que plusieurs copies d’une même brun (clusters)

• Il reste à séquencer les brins présents: Lors de cette étape, le nucléotide incorporé est identifié grâce à un groupe fluorescent identifié par laser, permettant d’enregistrer la séquence de manière informatique.

• https://www.youtube.com/watch?v=CZeN-IgjYCo

• https://www.youtube.com/watch?v=WneZp3fSJIk

Figure B: Schéma représentant les clusters sur une FlowCell

Figure C: Réaction de séquençage

Il est possible de créer une librairie enrichie en régions d’intérêt, par exemple pour séquencer uniquement les régions codantes du génome:

• Par capture: Il est possible de concevoir des sondes qui vont s’attacher à l’ADN d’intérêt, elle même étant liées à des molécules de biotines attachées à des billes magnétiques, qui sont conservées après lavage.
• par amplicon: Il est possible de faire une amplification sélectionnée par des amorces PCR choisies.

Pour le séquençage d’ARN (RNA-seq), il existe des étapes supplémentaire à la réalisation de la librairie:

• Sélection d’ARN non ribosomal par enrichissement
• Transformation en ADN, pour fonctionner avec les séquenceurs Illumina**

Il est avantageux d’obtenir des fragments de lecture les plus longs possible pour un alignement le plus fiable possible.

• Lors d’un séquençage simple (Single-end), les brins sont séquencés en partant d’un unique adaptateur. Un read correspond donc ensuite à un fragment.

• Lors d’un séquençage appairé (Paired-end), les brins sons séquencés à partir de leur deux extrémités. Les fragment résultats sont appelés R1 et R2 et sont liés, qu’ils soient recouvrant ou pas.

Un site expliquant cela de manière intéressante:

http://thegenomefactory.blogspot.com/2013/08/paired-end-read-confusion-library.html

Analyse de l’expression des gènes = le Transcriptome. C’est une grandeur dynamique.

• Technologie à haut débit précédente: les Puces à ADN.
• Technologie basée sur le NGS: Le RNA-seq.

Beaucoup d’outils sont communs à ces technologies.

Le NGS appliqué à l’analyse du transcriptome permet:

• Une meilleure concordance entre plateformes
• Une forte sensibilité et meilleure dynamique
• Toutes espèces, toutes régions transcrites
• Une variété d’applications (Analyse diférentielle, analyse de l’épissage alternatif, analyse des gènes de fusion, séquençage de novo)

Mais…: Complexité et coût calculatoire accrus = pipeline bioinformatique plus complexe par rapport aux microarrays.

• Séquençage
• Contrôle qualité
• Alignement sur génome de référence
• Quantification des valeurs d’expression (comptage) et normalisation
• Analyse différentielle entre conditions expérimentales
• Visualisation des données (“diagrammes de chaleur”, “volcano plots”).
• Analyse fonctionnelle des gènes (“Enrichment Analysis”)

L’analyse bioinformatique fait partie intégrante du processus de traitement.

Plusieurs questions possibles sur une analyse RNA-seq:

• Assemblage de transcriptome de novo
• Analyse de l’épissage alternatif
• Découverte des gènes de fusion
• Analyse différentielle: C’est cette application que nous allons décrire ici.

Ils contiennent les reads: petite séquence d’un fragment d’ADN de longueurs plus ou moins fixe.

• Single-end : Chaque read est indépendant et l’ensemble des reads sont stockés dans un fichier Fastq.
• Paired-end: Dans ce cas, les reads sont organisés par paires dans deux fichiers Fastq.

@HWI-ST865:166:D0C4KACXX:2:1101:1042:1954 1:Y:0:
CNANAAATNAANNNNGNNNNNNNNNANNNNNAAANNNTNNNNNNNNNTNNTGNNNNTTGTTTNNTTGTGGGTTTCTCTGTCCCCN
+
#####################################################################################
@HWI-ST865:166:D0C4KACXX:2:1101:1241:1970 1:N:0:
CCAGCGACACTTGCAGCTTAGGGGCAAGAGGCTCCCACAACACCCTGTGCGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGGATGCCGCGGCC
+
GFFIGIIIFGEHHIJJJIIGGGHIIBD=BFG?EDECC@FGCHC?BCCBB)53(;;B;?8299?######################

Il est important de stocker les données dans un emplacement fiable, avec beaucoup de mémoire vive et d’espace disponible, et accessible par un réseau rapide (Bref, un serveur de stockage).

Pour le traitement des données, un cluster de calcul sous Linux est idéal.

Il existe également des logiciels commerciaux sous Windows.

IGV (Integrated Genomics Viewer) est un explorateur de génome. Il permet de visualiser de l’information génomique le long du ou des chromosomes de l’organisme que nous sommes en train d’étudier.

• La première étape est de choisir un génome de référence (Exemple: hg19 ou mm10).
• Une boite permet de situer la position actuellement visualisée sur le chromosome.
• Les informations correspondant à chaque échantillon sont présentées sous forme de pistes (tracks).
• Les gènes sont affichés dans leur propre piste (annotation) avec les exons et introns. Il est possible d’afficher les transcrits individuellement.
• Plusieurs types de signaux peuvent être affichés (fragments de lecture, segments CGH, couverture, etc…).

STAR est un aligneur extrêmement précis qui peut dépasser certains aligneurs par un facteur 50 de vitesse. Par contre, il est très gourmand en mémoire.

Son principe de fonctionnement est basé sur deux étapes principales:

• Recherche de graines (seeds)
• Groupement (clustering), agrafage et calcul de score

Source: https://hbctraining.github.io/Intro-to-rnaseq-hpc-O2/lessons/03_alignment.html

Etape 1: Recherche d’alignement exact maximum pour chaque read (Maximal Mappable Prefixes - MMP) pour obtenir une liste de graines (seed1)

Etape 2: STAR va ensuite rechercher un alignement exact pour les portions non alignées des graines (appelées seed2).

Etape 3: Si l’alignement exact n’est pas possible, STAR va étendre la séquence recherchée.

Etape 4: Si l’alignement n’est toujours pas possible, STAR va couper les séquences adaptatrices ou contaminantes ou de faible qualité.

Etape 5: Groupement, Agrafage et Calcul de score. Les graines séparées sont groupées et agrafées sur la base sur leur proximité avec un site donneur pour créer un read complet.

Les annotations du génome de référence sont disponibles sous forme de fichiers GFF/GTF ou BED auprès de Ensembl (BioMart - https://www.ensembl.org/info/data/ftp/index.html) ou NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).

#!genome-build GRCh38.p13
#!genome-version GRCh38
#!genome-date 2013-12
#!genome-build-accession NCBI:GCA_000001405.28
#!genebuild-last-updated 2019-06
1   havana  gene    11869   14409   .   +   .   gene_id "ENSG00000223972"; gene_version "5"; gene_name "DDX11L1"; gene_source "havana"; gene_biotype "transcribed_unprocessed_pseudogene";
1   havana  transcript  11869   14409   .   +   .   gene_id "ENSG00000223972"; gene_version "5"; transcript_id "ENST00000456328"; transcript_version "2"; gene_name "DDX11L1"; gene_source "havana"; gene_biotype "transcribed_unprocessed_pseudogene"; transcript_name "DDX11L1-202"; transcript_source "havana"; transcript_biotype "lncRNA"; tag "basic"; transcript_support_level "1";

• Sous l’hypothèse que le nombre de reads venant d’un certain gène est proportionnel à l’abondance de son ARN dans la cellule, on compte les reads venant de chaque gène, transcrit ou exon du génome.

• Il est possible de faire un script ‘maison’ mais il existe maintenant un grand nombre de programmes pour faire cette fonction, notamment featureCount de la suite logicielle SubRead.

• Les localisations génomiques des objects génomiques (genome features) sont données en entrée du programme de comptage (Fichier d’annotation GTF/GFF), permettant d’assigner les comptages à chaque transcrit, gene, ou exon.

featureCounts permet de compter les fragments de lecture correspondant à chaque gène et d’obtenir un tableau récapitulatif pour l’ensemble de nos échantillons.

featureCounts du package subRead permet de faire ce comptage à partir des fichiers BAM résultants de l’alignement de séquences par STAR et un fichier d’annotation de génome au format GFF.

Il est possible de travailler en mode PE (Paired-End) ou SE (Single-End). Il n’est pas obligatoire de trier les BAM avant de les donner à featureCounts.

Les fragments de lecture sont assignés à des attributs (feature)out des meta-attributs (meta-features). Il y a donc 2 modes.

• Les attributs (features) correspondent à une zone contigue de l’ADN, par exemple un exon.

• Les meta-attributs (meta-features) correspondent à un object biologique résultant de l’assemblage de plusieurs attributs (les gène)

featureCounts peut compter au niveau des exons ou des gènes. Il est recommandé d’utiliser des identifiants uniques pour les meta-attributs, comme par exemple les geneID du NCBI, et d’éviter les noms de gènes.

Pour les alignements multiples, featureCounts peut les traiter de 3 manières:

• Les ignorer (Défaut pour la version bash)
• Les compter plusieurs fois
• Les compter plusieurs fois mais avec une contribution calculée en fraction (\(1/n\), \(n\) étant le nombre de fois ou le read apparaît).

Pour les alignements recouvrants plusieuts attributs, featureCounts peut les traiter de 2 manières:

• Les ignorer (Recommandé pour le RNA-seq)
• Les compter pour chaque attribut

featureCounts permet de compter les reads au niveau des exons (features) ou des gènes (meta-features). Par contre, Il n’est pas possible d’obtenir les reads pour les transcrits, car il ne peut déterminer à quel transcrit les assigner.

Ce type d’analyse est considérablement plus complexe. Pour ce faire, il faut utiliser un pipeline spécifique basé sur l’aligneur Salmon, qui permet d’assigner les reads aux transcrits sur une base de probabilité.

Voir la documentation pour l’aligneur Salmon: https://salmon.readthedocs.io/en/latest/salmon.html.

Nous avons différentes tailles de libraires, des biais de séquences dus à la PCR, ou un contenu RNA qui peut différer en échantillons. Il est donc nécessaire d’appliquer une normalisation pour rendre les échantillons comparables.

Méthode la plus utilisée: RPKM: Reads Per Kilobase per Million. Soir une valeur de comptage \(read(G)\) pouor un gène:

• On divise la taille de la librairie par \(10^6\). Cela nous donne le facteur par million.
• On divise la valeur de comptage \(read(G)\) par ce facteur pour obtenir des reads per millions (RPM).
• On divise la valeur RPM par la longueur du gène en Kilobases, pour obtenir des RPKM.

\(RPKM(G) = \frac{[\sum read(G)]}{[\sum Read].longueur(G)}.{10}^{6}.{10}^{3}\)

Variante: FPKM pour le Paired-end. Dans ce cas, deux reads peuvent appartenir au même fragment et ne sont pas comptés 2 fois.

On a également un problème de normalisation liée à la taille du gène.

Exemple de comptage RPKM pour deux échantillons différents:

• Transcrit 20kb, comptage 400, taille de librairie 20Millions de reads:

\(RPKM(t)= (400/20)/20 = 1\)

• Transcrit 0.5kb, comptage 10, taille de librairie 20Millions de reads:

\(RPKM(t)= (10/20)/0.5 = 1\)

Pas de détection en expression différentielle si on utilise cette transformation !.

De plus, elle est inadaptée à la comparaison entre échantillons car on ne peut pas comparer des pourcentages sur des librairies de taille différentes!

Méthode TPM: Transcripts Per Million

C’est une variante sur la méthode RPKM mais l’ordre des opérations change:

• On divise la valeur de comptage \(read(G)\) par la longueur du gène en Kilobases, pour obtenir des reads per kilobase (RPK).
• On somme les RPK pour l’échantillon et on divise par \(10^6\). Cela nous donne le facteur par million.
• On divise la valeur RPK par ce facteur pour obtenir des reads per millions (RPM).

\(RPK = \frac{\sum read(G)}{longueur(G)}.10^3\) (Read Per Kilobase)

\(TPM = \frac{RPK(G)}{\sum RPK}.10^6\)

Plus “acceptable” pour la comparaison d’échantillons car la somme totale des TPM est identique pour tous les échantillons.

Il faut voir une expérience RNA-seq comme un échantillonnage de l’espace des transcrits par la librairie.

Une expérimentation RNA-seq donne donc la proportion des transcrits pour une taille de librairie donnée.

Si un gène est fortement exprimé dans un échantillon et peu exprimé dans l’autre, on aura une augmentation artificielle de l’expression de l’ensemble des gènes (!).

TMM - Trimmed mean of M-values. C’est l’une des normalisations recommandées qui permet d’éviter l’effet des gènes fortement ou faiblement exprimés (Robinson & Oshlack. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology volume 11, Article number: R25, 2010).

Au lieu de faire une mise à l’échelle propre à une librairie, un facteur de normalisation global est calculé en assumant que la majorité des gènes n’est pas différentiellement exprimée et en ne tenant pas compte des valeurs extrêmes de comptages.

Ce facteur est calculé à partir de l’abondance relative de l’expression de chaque échantillon, soit un fold change global (Ce que l’on appelle les M-Values).

Un échantillon est choisi comme référence. L’abondance relative moyenne est calculée en “trimmant” les distributions de logFC (d’où le Trimmmed Mean), ce qui donne un facteur correctif pour chaque échantillon.

Il est calculable par le package d’analyse edgeR sous R/Bioconductor.

Autre normalisation: celle proposée par DESeq2.

Dillies et al. A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis. Brief Bioinform . 2013 Nov;14(6):671-83.

La Normalisation type TMM ou autre n’est nécessaire que pour la visualisation ou l’exploration globale des données de comptage (par exemple sous forme de carte de chaleur (heatmap)).

Les logiciels d’analyse différentielles (edgeR et DESeq2) ont leur propre normalisation intégrée à la méthode et il n’y a pas besoin d’appliquer de normalisation aux comptages avant un appel à l’une de ces méthodes.

Comparaison de la taille de librairies

Comparaison des distributions avant normalisation TMM

Comparaison des distributions après normalisation TMM

Comparaison des distributions avant normalisation TMM

Comparaison des distributions après normalisation TMM

Avant une analyse différentielle, il est important d’estimer les niveaux de variation d’expression des transcrits intra-groupes.

• \(Dispersion = BCV^2\)

• BCV= Biological Coefficient of Variation

Exemple: si l’expression d’un transcrit change de 20% entre réplicats, son BCV est de 0.2 et sa dispersion de 0.4.

L’objectif est d’établir quels sont les gènes différentiellement exprimés entre plusieurs conditions expérimentales, par exemple, un contrôle et un traitement. C’est une analyse supervisée.

Pour cela, un tests statistique est utilisé. Rappel: un test statistique est la vérification d’une hypothèse nulle H0.

Exemple d’une Hypothèse nulle: Les niveaux d’expression d’un gène en contrôle et traitement sont égaux. p-valeur: probabilité d’obtenir la même valeur du test ou plus extrême si l’hypothèse nulle était vraie.

Objectif: Modéliser l’expression de chaque gène comme une combinaison linéaire de facteurs multiples. Cela permet de tenir compte de plusieurs facteurs, tels que le groupe expérimental, le lot (effet batch), etc…

\(y = a + b.group + c. patient + d.lot + e\)

• \(y\) = Expression du gène.
• \(a\), \(b\), \(c\) et \(d\) = paramètres estimés
• \(a\) = intercept (valeur quand tous les paramètres sont à un niveau de référence)
• \(e\) = terme d’erreur

edgeR modèle les données en utilisant une distribution binomiale negative.

• Comparaison entre 2 groupes: test Simple
• Comparisons avec plusieurs facteurs : Utilisation des GLMs.

Exemple d’un design expérimental:

Dans cet exemple, nous cherchons à établir la liste des gènes différentiellement exprimés entre un contrôle (non traité) et des cellules traitées.

edgeR est un logiciel spécialement conçu pour l’analyse différentielle d’expression à partir de données obtenues par RNA-seq.

edgeR implémente de nouvelles méthodes statistiques basées sur les distributions binomiales négatives.

Cela le rend adapté aux analyses

• avec de nombreux facteur expérimentaux
• avec de petites tailles d’échantillons.

Robinson, MD. et al . (2010) edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data, Bioinformatics, 26 (1) 139-140.

Problème des tests multiples: Dans le cas d’un très grand nombre de tests, le nombre de faux positifs peut devenir très grand.

Il est donc nécessaire d’ajuster l’ensemble des p-valeurs par une correction pour tests multiples.

• Correction de Bonferroni: on divise les p-valeurs obtenues par le nombre de tests (très stringeant)

• Benjamini-Hotchberg: On contrôle la proportion attendue de faux positifs parmis les positifs: (False Discovery Rate)

L’idée est de contrôler la proportion de faux positifs parmis les positifs.

Pour cela, on transforme les p-valeurs de cette manière:

D’abord on tri les p-valeurs par valeur croissante.

Ensuite, on applique une transformation comme suit:

• La p-valeur la plus large n’est pas corrigée
• la seconde \(p=(p . n).(n-1)\)
• la troisième \(p=(p . n).(n-2)\) …
• la plus petite: \(p=(p . n).(n-n+1)=p.n\)

La p-valeur ajustée est le FDR.

MA-Plot: log(Ratio) vs average

• Appelé également Heatmap
• Normalisation par ligne ou globale pour l’affichage (Standardisation)
• Représentation d’une matrice de manière graphique, chaque valeur étant représentée par une cellule colorée.
• Les colonnes ou les lignes peuvent être ordonnée de plusieurs façons, soit manuellement, soit par une méthode de type clustering.

Lorsque l’on utilise un programme de modélisation statistique pour extraire les gènes différentiellement exprimés, on va s’intéresser prioritairement aux gènes ayant la p-valeur la plus basse. Or, il s’avère que des gènes faiblement différentiellement exprimés peuvent être associée à une faible p-valeur si leur expression est caractérisée par une faible variance intra groupes.

Il est donc important de considérer à la fois les gènes ayant une faible p-value et pour lesquelles on obtient un effet biologique intéressant, c’est à dire un logFC élevé.

Un diagramme en volcan est un nuage de point combinant l’effet statistique sur l’axe des ordonnées (p-valeur) et l’effet biologique (logFC) sur l’axe des abscisses.

Il est souvent représenté avec les seuils sur le logFC et de p-valeur utilisés pour sélectionner les gènes.

• Seuil utilisé: \(LogFC=1.5, pval=10^{-3}\)

• Seuil utilisé: \(LogFC=2.0, pval=10^{-5}\)

• Fichiers de séquences brutes: .Fastq (Compressé: .Fastq.gz)
• Fichiers de séquences alignées .bam
• Index de fichiers de séquences alignées: .bai
• Génome complet au format FASTA: .fa
• Fichier d’expression: Délimité par des tabulations: .txt, .tdf ou .csv.

• Contrôle Qualité (FASTQC)

• Trimming (Trimmomatic)

• Alignement sur le génome de référence (TopHat (Spécifique RNA-seq), SubRead (Générique), STAR (Spécifique RNA-seq))

  ou

• Alignement sur transcriptome de référence(Salmon)

• Comptage (FeatureCount)

• Analyse différentielle (edgeR ou DESeq)

• Visualisation des données (Morpheus, Bioconductor)

• Analyse des données (Gene Set Enrichment Analysis)

• Il faut des réplicats biologiques (!)

• La normalisation est nécessaire pour comparer l’expression entre échantillons

  • Différentes tailles de librairies

  • Biais de séquences

• Les programmes d’analyse d’expression différentielles (edgeR, DESeq2) ont besoin des comptages bruts (Pas les RPKM ou autre)

• Il faut corriger pour les tests multiples.

• Il existe une normalisation sur les données analysées (les comptages), appelée RPKM, TMM, ou autre…

• Il existe également une “normalisation” qui consiste à faire une standardisation de l’affichage des heatmaps (affichage centré-réduit par ligne sous forme de z-score).

• En analyse NGS, la bioinformatique et l’infrastructure bioinformatique ne sont que peu ou pas importantes face au séquençage lui-même: (Vrai/Faux)

• Remettre dans l’ordre les phases d’analyses RNA-seq suivantes:

  • Alignement
  • Comptage des reads
  • Visualisation
  • Analyse Différentielle
  • Contrôle Qualité

• Faire correspondre les logiciels suivants à ces différentes étapes:

  • STAR
  • IGV
  • FeatureCounts
  • FastQC
  • edgeR